(CE) - csirkeembrió az embrionális fejlődés különböző szakaszaiban. A mikrobiolban. A gyakorlatot vírusok, rickettsia és néha baktériumok izolálására, tenyésztésére és azonosítására használják. Laboratóriumi célokra válasszon friss, trágyázott, jól áttetsző és repedésmentes EC-héjjal. Az inkubálást az állvány fészkében, a tojás tompa végével felfelé, jól szellőző inkubátorokban vagy termosztátokban végezzük 37-37,5 °C-on, relatív páratartalom 63-65%. A fertőzéshez válasszon 4-13 napos embriókat kifejezett erekkel, sárgájazsákkal és mozgékony árnyékkal. Fertőzés előtt a tojáshéjakat alkohollal kezelik, megégetik és az injekciós területen (általában a légkamra felett) 2%-os jódotinktúrával kenik be. Anyag vagy kutatás A to-ru-t, a héj kinyitásával vagy anélkül, a sárgájazsákba (rickettsia), az allantois vagy a magzatvíz üregébe (a legtöbb vírus) juttatják, a chorion-allantois membránra helyezve. A to-py-t ritkábban fecskendezik be az embrió testébe vagy intravénásan. A fertőzött CE-ket termosztátba helyezik a mikroba típusától és a kutatási céloktól függő feltételek mellett és időtartamra. A fertőzés eredményeire vonatkozó adatok a CE külső mikroszkópos vizsgálatával nyerhetők (érinjekció, mobilitás elvesztése stb.). A legtöbb esetben azonban a CE megnyitásra kerül. Ehhez alkoholos és jódotinktúrával történő kezelés után Pasteur pipettával vagy fecskendővel levágják a légzsák határa felett a héjat, először az allantois-, majd a magzatvizet szívják le, elkerülve az erek és a tojássárgája károsodását. zacskó. Az embriót és a chorionallantois membránt eltávolítjuk a héjból, steril edényekbe helyezzük, steril desztillált vízzel mossuk. vizet és megvizsgálni. Az embrió és folyadékai vizsgálatának további menete a mikroba vagy vírus típusától és a kísérlet céljaitól függ.

Óra értéke Csirke embrió más szótárakban

Csirke- lásd csirkék.
Dahl magyarázó szótára

Csirke Adj.- 1. Érték szerint megfelelő. főnévvel: csirke társul hozzá. 2. A csirkére jellemző, rá jellemző. 3. A csirke tulajdona. 4. Húsból készült, csirkehússal. 5.........
Efremova magyarázó szótára

Csirke- csirke, csirke. 1. App. a csirkéhez. Csirke toll. || Csirkehúsból készült. Csirkeszelet. húsleves. 2. jelentésében. főnév csirke, csirke, szerk. csirke, csirke, vö. Egy csapat madár, ........
Ushakov magyarázó szótára

Csirke- th, th.
1. a Csirkéhez és a Csirkéhez. K-edik toll. K-edik csontok. K-edik csattanás. K-edik szelet. K. húsleves. // Például csirke, csirke. K-edik mellkas (oldalról összenyomott, erősen előrenyúló .......
Kuznyecov magyarázó szótár

Csirke Isten- az orosz faluban a mai napig. XX század rituális tárgy, általában egy átmenő lyukkal ellátott kő, amely madárfejre emlékeztet, és amelyet talizmánként egy csirkeólba akasztottak .........
Történelmi szótár

CSIRKE- CSIRKE, th, th. 1. lásd csirke. 2. csirke, -kh- Madarak különítménye, amelybe házi csirkék, pulykák, fácánok, gyöngytyúkok és mások tartoznak.
Ozsegov magyarázó szótára

EMBRIÓ- EMBRION, -a, m, (különleges). Az embrió (1 értékben) a fejlődés kezdeti szakaszában. || adj. embrionális, th, th és embrionális, th, th (elavult). Embrionális fejlődés.
Ozsegov magyarázó szótára

EMBRIÓ- EMBRYO, embryo, m.(görög embrió) (könyv). 1. Embrió (növény, állat; biol.). 2. átadás. Ugyanaz (gondolatról, ötletről stb.). A művészi tervezés embriója.
Ushakov magyarázó szótára

Embrió- m. 1. Az emberi vagy állati szervezet a fejlődés kezdeti szakaszában; embrió. 2. átadás. köznyelvi Egyesek kezdetlegessége gondolatok, ötletek stb.
Efremova magyarázó szótára

EMBRIÓ- EMBRYO (görög embrion - embrió), a fejlődés korai szakaszában lévő állati szervezet, megegyezik az embrióval. Növényekkel kapcsolatban csak az "embrió" kifejezést használjuk .. (

Vírusok izolálása laboratóriumi állatokban.

A laboratóriumi állatok kiválasztása a vírus típusától függ. A laboratóriumi állatok biológiai modellek. Néha 3-5 „vak”, tünetmentes átoltás szükséges ahhoz, hogy a vírust a laboratóriumi körülményekhez alkalmazkodni lehessen. A laboratóriumi állatok azonban nem fogékonyak bizonyos vírusokra, ebben az esetben természetesen fogékony állatokat kell használni. Mint például a sertéspestis és a lovak fertőző vérszegénysége esetén.

A laboratóriumi állatok fertőzésének célja:

1. A betegség patogenezisének tanulmányozása;

2. izolálja a vírust a pat.material-ból;

3. Immun- és hiperimmun szérumok előállítása;

4. Vakcinák előállítása;

5. Vírusok karbantartása laboratóriumi körülmények között;

6. Titrálás az egységnyi térfogatú vírus mennyiségének meghatározására;

7. Biológiai modell a semlegesítési reakció beállításához;

A laboratóriumi állatok fertőzésének módszerének megválasztása a vírus tropizmusától függ. Így a neurotróp vírusok tenyésztése során az állatok az agyba fertőződnek; légúti intranosalisan, intratrachealisan; dermatróp - szubkután és intradermálisan.

A fertőzést az aszepszis és az antiszeptikumok szabályainak betartásával végezzük.

Számos módja van a vakcinázott anyag bejuttatásának az állatok testébe:

Bőr alatti; - Intracerebrális; - Intradermális;

intraperitoneális; - Intramuszkuláris; - Intraokuláris;

Intravénás; - Intranosalis; - Tápláló;

A fertőzés után az állatokat felcímkézzük, elkülönített dobozba helyezzük, és 10 napig megfigyeljük. Az állat elhullása a fertőzést követő első napon nem specifikusnak minősül, és a jövőben nem veszik figyelembe.

3 jel jelzi a fertőzés hatékonyságát:

Klinikai tünetek jelenléte

Egy állat halála

Kóros változások (a szerv mérete, alakja, színe és állaga).

A csirkeembriókat megtermékenyítik tojás amelyben az embrió (embrió) fejlődik. Vírusok tenyésztése csirke- és fürj embriókon Utóbbi időben széles körben elterjedt, mint az egyik legegyszerűbb és legmegbízhatóbb módszer számos vírus és néhány baktérium - brucella, rickettsia, vibrios - tenyésztésére és diagnosztizálására.

Számos emberi és állati vírus tenyészthető fejlődő csibeembriókban. Az embrionális hámszövetekben gazdag embrionális szövet, különösen az embrionális membrán, számos vírus szaporodásához kedvező környezet. A hámtulajdonságokkal rendelkező vírusok (himlő, ILT stb.) sikeresen fejlődnek a chorionallantois membránon, makroszkóposan látható elváltozásokat okozva. A mixovírusok különböző képviselői (influenza, Newcastle-kór, ragadozó pestis stb.), a fertőző hörghurut vírusai, a kiskacsák májgyulladása, az arbovírusok stb. jól szaporodnak az embrióban, amikor az anyagot az allantois üregébe injektálják. Egyes vírusokat sikeresen tenyésztettek a tojássárgája tasakban.

Előnyök:

1. Költséghatékony, ráadásul a tojás könnyen beszerezhető;

2. A fejlődő csibeembriókban hiányoznak a védekező mechanizmusok, mert az immunrendszer még nem fejlődött ki;

3. A tojások héja megakadályozza a baktériumok és vírusok behatolását rajta. környezet;

A vírusok csirkeembriókon történő tenyésztéséhez és izolálásához nagyon egyszerű felszerelésre van szükség - egy közönséges termosztátra vagy inkubátorra.

Körülmények:

1. A tojásokat olyan gazdaságokból nyerik, amelyekről ismert, hogy biztonságosak fertőző betegségek;

2. Csirke embriók jobb fehér csirkefajtákból (Leghorn, Russian White) beszerezni, mivel ezek jobban ellenállnak a manipulációnak és nem halnak bele apró sérülésekbe. Ezenkívül a héjuk fehér és átlátszóbb, mint más fajtáké, és könnyebben átlátható, ami kényelmes a megtekintéshez és a megfigyeléshez, miközben dolgozik velük;

3. Az inkubációhoz válasszon megtermékenyített tojásokat, amelyeket legfeljebb 10 nappal ezelőtt raktak le;

4. Szennyezetlen petéket vesznek fel, mivel azokat nem lehet lemosni az inkubáció előtt, és a piszkos tojások jobban átvilágítanak, ha megnézik (ovoszkópia), és amikor velük dolgozik, az embrió a manipuláció során megfertőződhet;

A tojásokat inkubátorban vagy vízmelegítésű, levegővel ellátott termosztátban keltetik, a termosztátos keltetés során pedig a tojást naponta 2-3 alkalommal meg kell fordítani, és a jobb gázcsere érdekében 5-10 percre ki kell venni. levegő. Egy bizonyos páratartalom fenntartása érdekében a termosztátba egy elpárologtató vizet tartalmazó edényt helyeznek, a termosztát hőmérsékletének 38 ° -nak kell lennie.

Az embrió fejlődése már az inkubáció első napján megtörténik, megtörténik az agy és a csontváz lerakása. A csirkeembrió szerkezete 7-9 napos korban(lásd a jegyzetfüzetet).

Fertőzésre leggyakrabban 7-12 napos embriókat használnak. A csirkeembriókkal végzett munka steril dobozban történik, az aszepszis legszigorúbb betartása mellett.

A csirkeembriók megfertőzésének célja:

1. Válassza ki a sort a pat.material;

2. vakcinák előállítása;

3. A vírus fenntartása laboratóriumi körülmények között;

4. Vírusok titrálása;

5. Biológiai modell a semlegesítési reakció beállításához;

6. Vírusok interferenciájának és interferontermelésének vizsgálata; A csirkeembriók fertőzése:

A fertőzéshez életképes, jól meghatározott mobilitású embriókat kell kiválasztania. A fertőzés előtt minden embriót gondosan megvizsgálnak egy elsötétített szobában ovoszkópon.

Az embriók fertőzés előtti átvilágítása során a pugu (légüreg), a nagy erek lefutása és az embrió megjelenési helye, azaz a héjon az a terület, ahol az embrió a hozzá legközelebb fekszik, rajzolódik a kagyló egy egyszerű ceruzával. A puga jele, az embrió megjelenési helye és a nagy erek lefutása ezután iránymutatóul szolgál a beoltott anyag fertőzéskori beadásának helyének kiválasztásánál.

A fertőzésre kiválasztott csirkeembriókat egy dobozba helyezik át, ahol dolgoznak velük. A fertőzés előtt az anyag bevezetésének helyén lévő héjat kétszer kezelik jódozott alkohollal és kiégetik. A fertőzés dózisa 0,1-0,2 cm.

A vírus típusától és a fertőzés céljától függően különbözőek lehetnek a vakcinázott anyagok bejuttatásának módjai:

1) Chorionallantois membrán fertőzés , 7-12 napos embriókat neurotrop, dermatrop és egyes pantropikus vírusok (himlő, agyvelőgyulladás, ILT, száj- és körömfájás, veszettség, pestis stb.) izolálására és tenyésztésére használnak. A fertőzésnek 3 típusa van:

a) nyissa ki a pogot és vágja le ollóval, válassza le a héj membránját és vigye fel anyagot a chorionallantois membránra (HAO). A tojásban lévő lyukat ezután steril üvegkupakkal lezárjuk, és a kupak széleit viaszoljuk;

b) reszelővel (reszelővel) vagy rovátkolt szikével a kagylóba vágjon ki egy kb. 1 cm oldalhosszúságú háromszöget a pugi peremén az embrió bemutatásának oldaláról, távolítsa el a héj egy részét, és csipesszel aláhéjat és fecskendezze be az anyagot. A lyukat steril üvegfedéllel zárják le, a széleit viaszolják vagy steril ragasztószalaggal lezárják.

c) az embrió bemutatásának helyén a héj egy kis, körülbelül 0,5 cm-es területét szikével eltávolítjuk, majd ezen a területen csipesszel vagy tűvel eltávolítjuk a héj alatti membránt és az anyagot befecskendezik. Ha az anyag nem illeszkedik jól a tojás üregébe, gumi izzóval pumpálhatja ki a levegőt a pogóból a gombon lévő héjon lévő lyukon keresztül, és ennek eredményeként mesterséges pogu képződik a helyen. az anyag bevezetése, majd az anyag könnyen bevezethető. A héjon lévő lyukat ragasztógipsszel zárják le vagy viaszolják.

2) Fertőzés az allantois üregbe. Ez a fertőzési módszer nagyon egyszerű, és számos vírus izolálására használják. A fertőzéshez 10-11 napos embriókat vesznek. Kétféle fertőzés létezik:

a) a fertőzést a mopszon keresztül hajtják végre, anélkül, hogy levágnák. Tűvel mérjük meg a kagylóhéjon ceruzával megjelölt távolságot a móló tetejétől a máglya határáig, majd szúrjuk be a tűt a megjelölt mélységig, és mélyítsük még 0,5 cm-rel a chorionallantois membrán átszúrásához;

b) az anyagot tűvel fecskendezik be a héjon keresztül az embrió bemutatásának helyén 3-5 mm mélységig az érrendszeri területen. A héjon lévő lyukat ragasztógipsszel zárják le vagy viaszolják.

3) Fertőzés a sárgája zsákban. A fertőzéshez 5-8 napos embriókat használnak. Kétféle fertőzés létezik:

a) a tűt a mopsz oldaláról ovoszkóp felügyelete alatt az embrió bemutatásának helyéhez képest 45°-os szögben a tojássárgája zsákba szúrják;

b) a tojást szintén állványra helyezzük úgy, hogy az embrió lefelé nézzen, és a tűt felülről lefelé az embrió felé szúrjuk körülbelül 1 cm mélységig.

Az injekció beadási helyét ragasztógipsszel le kell zárni és viaszolni kell. 4) Fertőzés a magzatvíz üregébe. Ezzel a fertőzési módszerrel a vírus behatolhat a magzatvízzel érintkező különféle sejtekbe, és elszaporodik bennük. a fertőzés kényelme érdekében az embriókat a fertőzés előtt 2-3 nappal, ijedtséggel felfelé javasolt inkubálni. Ezután az embrió és az amnion felfelé mozog, és kényelmesebb a fertőzés. Kétféle fertőzés létezik:

a) a gombát felnyitjuk és levágjuk, a héj membránját csipesszel eltávolítjuk és az amniont befogjuk, csipesszel kihúzzuk és az anyagot 0,1 ml-es adagban a magzatüregbe fecskendezzük. A héj lyukát ezután steril üvegkupakkal lezárjuk, és a széleit viaszoljuk;

b) fertőzés hosszú tűvel egy sötét helyiségben, a szem felügyelete alatt lévő gombon keresztül A tűt előzetesen derékszögben meghajlítják, hogy egy kis területet képezzenek. A tűt a szem irányítása alatt szúrják be az előembrió mopszán keresztül, a tompa tű nyomására, az embrió ilyenkor elmozdul, majd egy könnyű nyomással átszúrják az amniont, és kissé meghúzzák a tűt. vissza. Ebben az esetben az embriónak felfelé kell mozognia a tű mögött. Ezután bevezetik az anyagot.

5) Fertőzés az embrió testében és fertőzés az agyban. 7-12 napos embriókat használnak, a fertőzést úgy hajtják végre, hogy az anyagot a test különböző részeibe vagy közvetlenül az agyba juttatják. A fertőzéshez a pogu kinyitják, és az embriót csipesszel kihúzzák. Ezekkel a fertőzési módszerekkel az embriók traumából eredő elpusztulása a fertőzöttek számának akár 30%-át is elérheti.

6) Fertőzés a chorionallantois membrán nagy ereiben. Ezt a fertőzési módszert az előzőhöz hasonlóan nagyon ritkán használják. Az anyagot vékony tűvel fecskendezik be, miután eltávolították a héjat az ér mentén, közvetlenül a véráram mentén az érbe.

Fertőzés után a csirkeembriókat egyszerű ceruzával meg kell jelölni, és termosztátba kell helyezni. Naponta megtekintéssel figyelik őket, a megfigyelést a vírus típusától függően legfeljebb 7-8 napig végzik. Az embriók elhalása esetén sürgősen ki kell venni a termosztátból, és kinyitásig hűtőszekrénybe helyezni. Ha az embrió az első 14-18 órán belül elpusztult, annak oka lehet a trauma vagy a kóros anyag toxicitása. Ezért, mint a laboratóriumi állatok fertőzése esetén, kétes esetekben ajánlatos a kísérlet során több passzálást végezni és minden anyaghoz több embriót venni.

Az elhullott fertőzött, illetve a megfigyelési időszak után eltávolított csirkeembriók boncolása az aszepszis szabályai szerint steril boxolási körülmények között történik. Felnyitáskor a héjat alkohollal kezeljük és kiégetjük, majd a pogu levágjuk. A felnyílt embriónál először óvatosan leszívják az allantois folyadékot (mennyisége kb. 7 ml), majd a magzatvíz membránját csipesszel lehúzzák, Pasteur pipettával átszúrják és leszívják a magzatvizet (mennyisége 1,0-1,5). ml), majd a sárgáját összegyűjtjük, a membránokat eltávolítjuk és az embriót eltávolítjuk. A folyadékot, a membránokat és magát az embriót gondosan megvizsgálják az elváltozások szempontjából. A magzatvíz általában teljesen átlátszó, fertőzött állapotban zavaros, véres lehet. A vírus okozta jellegzetes elváltozások leginkább a chorionallantois membránon jelentkeznek: gyulladásos gócok jelennek meg, kerek formaés vérzés. Vérzések lehetnek az embrió testén. Az összes anyagot steril tartályba kell gyűjteni.

A virológiában a csirkeembriókat széles körben használják nemcsak vírusok izolálására, hanem antigének felhalmozására és kinyerésére, élő és elölt vakcinák készítésére, vírusok titrálására, vírussemlegesítési reakció lebonyolítására, vírusok attenuálására (gyengítésére), vírusok interferenciájának tanulmányozására. vírusok és interferon beszerzése...

A virológia fejlődésében nagy jelentőséggel bírt a csirkeembriók vírustenyésztésére szolgáló módszerek bevezetése. A vírus szaporodásához 7-12 napos csirkeembriókat használnak, termosztátban 37 ° C-on inkubálva. A vírusok csirkeembriókban történő tenyésztését a fertőzött embrió különböző helyein végzik:

1) a chorion-allantois membránon;

2) az allantois üregbe;

3) a magzatvíz üregébe;

4) a tojássárgája zacskóba.

A csirkeembriókat egy dobozban steril eszközökkel fertőzik meg. A fertőzés előtt a csirkeembriókat kétszer töröljük le alkohollal megnedvesített vattacsomóval.

Fertőzés a chorion-allantois membránon. A fertőtlenítés után a tojások tompa végéről óvatosan levágunk egy darab héjat, eltávolítjuk a héjhártyát - és megtaláljuk a chorion-allatiois hártyát. A fertőző anyagot fecskendővel vagy Pasteur-pipettával 0,1-0,2 ml mennyiségben alkalmazzuk a chorion-allantois membránra. Fertőzés után a lyukat kupakkal lezárják, és a közte és a csirkeembrió közötti rést paraffinnal töltik fel. A tojás másik oldalára írjuk ceruzával a fertőző anyag nevét és a fertőzés időpontját.

Fertőzés a magzatvíz üregébe. A petesejtet ovoszkóppal vizsgálják, és az oldalsó oldalon kiválasztanak egy helyet, ahol a chorion-allantoisban nincsenek nagy erek. Ez a terület ceruzával van megjelölve. A tojásokat vízszintes helyzetben állványra helyezzük, fertőtlenítjük és speciális steril lándzsával lyukat szúrunk. és héj 2-3 mm mélységig, amelyen keresztül egy fertőző anyagot tartalmazó tűt szúrnak be ugyanolyan távolságra közvetlenül a magzatvíz üregébe. Annak érdekében, hogy a befecskendezett folyadék ne folyjon vissza, előzetesen átszúrják a légzsákot. Ezután mindkét lyukat megtöltjük paraffinnal.

Fertőzés az allantois üregbe. A fertőzést árnyékolt dobozban is végezzük. A légteret feljegyzik, a légtér feletti héjat fertőtlenítik, és az anyagot tartalmazó fecskendőtűt a héjon lévő lyukon keresztül az embrió felé szúrják. Ha a tű az allantois üregébe ütközik, akkor az embrió árnyéka elmozdul. Fertőzés után a lyukat paraffinnal töltik fel.

Fertőzés, a sárgája zsákban. A héj fertőtlenítve van. A tojást egy állványra tesszük, tompa végével jobbra úgy, hogy a sárgája nyomai felfelé nézzenek. A légkamra fölött középen egy lyuk van kilyukadva. A héjban lévő lyukon keresztül a héjban vízszintes irányban 2-3 mm mélységig egy fecskendőtűt szúrnak be, amely belép a sárgájazsákba. Az anyagot 0,2-0,3 ml térfogatban fecskendezzük be. Az anyag bevezetése után a lyukat viaszoljuk.

A hőmérsékleti rendszer és az inkubáció időtartama attól függ biológiai tulajdonságait ennek a vírusnak. A fertőzött petéket naponta ellenőrzik, ovoszkópiát az embrió életképességének ellenőrzésére. Ha az embriók az első napon elpusztulnak, akkor ennek oka általában a fertőzés során okozott trauma. Az ilyen tojások tapasztalatból származnak. A vírus jelenlétét a fertőzött embrióban a fertőzött csirkeembrió chorion-allantois membránjának jellegzetes változásai határozzák meg. A hemagotináló aktivitással nem rendelkező vírusokat CSC-k segítségével észlelik. A vírus kimutatására a fertőzött embriók allantois- vagy magzatvízében RHA-t helyeznek el.

Mióta kiderült, hogy az influenzavírusok szaporodnak a csibeembriókban, ez a módszer széles körben elterjedt a virológiában, mivel könnyen használható és nem drága.

7-9 napos csirkeembriókat használnak (a teljes fejlődési ciklus 21 nap).

Fertőzés előtt a felületet alkohollal, jódoldattal kezeljük, lyukat készítünk a héjon, és steril fecskendővel megfertőzzük.

Fertőzés módjai: a magzatüregbe, az allantois üregbe vagy a petezsákba. A vírusok a megfelelő membránokon felszaporodnak, felhalmozódnak az üregfolyadékban, amit aztán össze lehet gyűjteni további kutatás céljából.

Az embriókat 37 fokon tenyésztik. 3 nap, majd a héjat újra feldolgozzuk, az embriót steril eszközökkel felnyitjuk és a beoltott folyadékot összegyűjtjük. A fertőzéssel és a boncolással kapcsolatos minden munka a dobozban történik.

Tenyésztés sejttenyészeteken.

A sejttenyészeteket ben kezdték használni a virológiában az elmúlt évtizedek, ez lehetővé tette a vírusok sokkal szélesebb körének tenyésztését és tanulmányozását, mivel nem minden emberi vírus izolálható állatokban vagy embriókban. Így a modern virológia sejttenyészeteket használ, amelyekből nagyon sokat sikerült előállítani.

Sejtkultúrák fajtái

a) elsődleges - embrionális szövetből nyerik, zúzzák, tripszinnel feldolgozzák a sejtek dezaggregációja (leválasztása) és további tenyésztése céljából

in vitro speciális tápfolyadékban.

b) átültetett- daganatszövetből nyerik, abban különböznek, hogy korlátlan ideig termeszthetők, csak a táptalajt és az edényeket cserélik.

A termesztés során egyrétegű réteget kapunk az üvegen : vagyis egy sejtréteg.

Most már megfertőzheti ezeket a sejteket a vizsgált anyaggal a feltételezett vírussal vagy már meglévő vírusokkal. A fertőzött és nem fertőzött sejteket tartalmazó edényeket termosztátban tenyésztik 37 fokon.

A sejttenyészetben a virionok felhalmozódási folyamata körülbelül 48-72 óráig tart.

A megfelelő haszonnövények kiválasztásával gyakorlatilag minden emberi vírus tenyészthető.

A vizsgálat következő szakasza a vírusok indikációja és azonosítása.

Indikációs módszerek.

Jelzés - ez a vírusok kimutatása közvetlenül a vizsgálati anyagban vagy a tenyésztőfolyadékban vagy a fertőzött sejtekben.

I. Ha a virionok folyadékban vannak, akkor a hemagglutinációs reakció segítségével kimutathatók.

A reakció lényege: bizonyos típusú vírusok képesek spontán ragasztani (vagyis hemagglutinációt okozni) bármely vörösvértestet. Például az influenza virionok összetapadnak a csirke eritrocitáival, egyes adenovírusok – patkányvörösvértestek stb.

Így az eritrociták sóoldatban készült szuszpenziója segítségével a vírusok kimutathatók a vakcinázott folyadékban.

II. Ha a vírusok szaporodnak a sejttenyészetben, de hemagglutinálóak, akkor a hemadszorpciós reakcióval kimutathatók: vörösvértest szuszpenziót viszünk a tenyészetre, inkubáljuk, lecsepegtetjük - ha a tenyészet fertőzött, akkor az eritrociták közvetlenül a tenyészethez tapadnak. fertőzött sejtek – ez fénymikroszkóp alatt látható.

III.Egyéb hatások:

a) a vírusok az egyrétegű réteg pusztulását okozzák – ezt nevezik a vírus citopatogén hatásának – CPP.

b) a vírusok morfológiai változásokat okoznak a sejtekben: intracelluláris vagy intranukleáris zárványok, syncytium, szimplasztok képződése (vagyis több sejt egy formációba olvadása a sejtmembrán károsodása miatt).

Az óra célja: megismertetni a hallgatókkal a csirkeembriók fertőzésének módszereit vírustenyésztéshez.

Felszerelés és anyagok: csirkeembriók 9-12 napos inkubációs korig, ovoszkóp, alkoholos törlőkendők, embrióállványok, csipeszek, olló, ragtapasz, tűk, fecskendők, ceruzák, lyukasztók, tűk, táblázatok, diagramok, multimédiás eszközök, prezentációk MS Office Power Point az óra témájában.

A tanár magyarázata.

A fertőzés módja jelentősen befolyásolja a vírusok reprodukcióját az embriókban. A fertőzés előtt a kelt tojásokat megvilágítják, az elhullottakat elkülönítik. Az élő embriókkal rendelkező tojások héján, amelyeket az erek vörös színe és az embrió mozgása különböztet meg, ceruzával jelölje meg a fertőzés helyét.

Az embriókat egy steril dobozban fertőzik meg munkaasztallal, két székkel, gázellátással, vízellátással és vákuummal. A magzatvíz üregébe történő fertőzést elsötétített helyiségben végezzük. A munkahelynek jól megvilágítottnak kell lennie. Az asztalt munka előtt fertőtlenítjük. A tojások felületének fertőtlenítésére fertőtlenítő oldatot (70%-os alkohol, 2%-os jódoldat) és vattába csavart fabotot, hajlított fogszondát vagy fúrófúrót készítenek. tojáshéj... A tojásokat steril tuberkulinizáló fecskendővel és speciális tűkkel szennyezik. A tojás fertőzési helyét paraffin borítja. Ehhez paraffinrudakat készítenek: az olvadt paraffinnal töltött kémcsőbe egy üvegrudat helyeznek, ügyelve arra, hogy a cső közepén legyen, amíg a paraffin ki nem hűl.

Ha paraffinpálcikára van szükség, a kémcső falait égőn felmelegítjük, és a paraffint üvegpálcikával kihúzzuk a kémcsőből. A botot a láng felett tartva megolvad a tojásban lévő lyuk bezárásához szükséges mennyiségű paraffin. Ez a módszer nagyon tiszta, és nem termel paraffingőzt.

Ezenkívül a dobozban lévő munkaasztalra helyezünk egy pohár steril vattakorongokkal, egy pohár 3%-os nátrium-hidroxid oldattal a használt műszerekhez és egy klóramin oldattal ellátott edény a használt üvegtárgyak számára. Szükség esetén tojástartót, kis zománcozott tálat és steril táptalajt készíthet. Az így elkészített munkaasztalt 1-2 órán keresztül UV-sugárzásnak tesszük ki.

Figyelembe véve a vizsgált vírusok patogenitását, a munka maszkban, gumikesztyűben és védőszemüvegben történik.

Hat módszer létezik az embriók megfertőzésére. A fertőzést leggyakrabban az allantois üregében és a chorionallantois membránban, ritkábban a magzatüregben és a tojássárgájában, valamint nagyon ritkán az embrió testében és a CAO ereiben alkalmazzák. A módszer megválasztását a vírus tropizmusa, valamint a fertőzés célja határozza meg. Bármilyen fertőzési módszerrel 0,1-0,2 ml fertőző anyagot fecskendeznek be.

Fertőzés az allantois üregbe.

Ezzel a módszerrel megfertőzve jól elszaporodnak az influenza, a Newcastle-kór, a lovak orr-pneumoniája, a hólyagos szájgyulladás stb. vírusai A módszernek több változata is létezik.

Első lehetőség. Az embriót függőlegesen, tompa véggel rögzítik. Körülbelül 1 mm átmérőjű lyukat készítenek a héjban az embrió oldalán, néha pedig az embrióval ellentétes oldalon 5-6 mm-rel a légkamra határa felett. A tűt a hosszanti tengellyel párhuzamosan 10-12 mm mélységig szúrjuk be (16. ábra). A vakcinázott anyag befecskendezése után a tűt eltávolítjuk, és a héjon lévő lyukat egy csepp olvadt steril paraffinnal lezárjuk.

16. ábra: Fertőzés az allantois üregben (első lehetőség) (Nicolau szerint)

Második lehetőség. A légkamra feletti héjban kialakított lyuk csak a levegő egy részének kiengedésére szolgál. Magának a fertőzésnek a lyuk a chorionallantois membrán (CAO) vaszkuláris zónájának helyén van kialakítva az embrió oldaláról. A tűt legfeljebb 2-3 mm mélységig szúrják be. A fertőző folyadékot 0,1-0,2 ml térfogatban fecskendezzük be, és a lyukat paraffinnal lezárjuk (lásd 17. ábra).

Fertőzés a chorionallantois membránon.

A csirkeembriók megfertőzésének ezt a módszerét gyakrabban alkalmazzák hám- és pantropikus himlővírusok, madarak fertőző gégegyulladása, húsevők pestisének, Aujeszky-kór, juhok hurutos lázának stb.

Az ilyen szennyeződés természetes vagy mesterséges légkamrán keresztül történhet.

Fertőzésre természetes légkamrán keresztül az embriót függőlegesen, tompa végével felfelé állványba helyezzük, és a légkamra középpontjával szemben a héjba 15-20 mm átmérőjű kerek ablakot vágunk. Ezen az ablakon keresztül a héj membránját csipesszel távolítják el. 0,2 mm-es vakcinált szuszpenziót viszünk fel a CW szabad területére (18. ábra), a lyukat ragasztógipsszel vagy ritkábban olvadt paraffinnal megerősített fedőüveggel zárjuk le.

Fertőzés mesterséges légkamrán keresztül gyakrabban használják, mint az elsőt, mivel ez biztosítja a vakcinázott anyag érintkezését a CAO nagyobb felületével, és ezért nagyobb mennyiségű vírus kialakulásához vezet.

17. ábra: Csirkeembrió fertőzése az allantois üregbe (második lehetőség) (Nicolau szerint)

18. ábra: Fertőzés a HAO-nál természetes légkamrán keresztül (Nicolau et al. szerint)

19. ábra: Csirkeembrió fertőzése HAO-ban mesterséges légkamrán keresztül (Nicolau et al. szerint)

Az embrió ezzel a módszerrel történő megfertőzéséhez vízszintesen, az embrióval felfelé kell egy állványba helyezni. A héjon két lyuk van: az egyik kicsi a légkamra közepe fölött (levegő kiszívására van kialakítva), a másik pedig 0,2-0,5 cm átmérőjű oldalról, az embrió oldaláról. A módszer bonyolultsága abban rejlik, hogy a második lyuk készítésekor először óvatosan el kell távolítani a héj egy darabját, majd csúszó mozdulatokkal a HAO sérülése nélkül oldalra kell mozgatni a héjat, hogy a levegő átjusson rajta. a kialakult hiba. Ezután egy gumiburával az első lyukon keresztül levegőt szívunk a természetes légkamrából (19. ábra, a), ennek eredményeként az oldalsó lyukon keresztül külső levegő befelé rohan, mesterséges légkamrát alkotva, melynek alja a HAO (19. ábra, b).

A HAO felületére az oldalsó lyukon keresztül fertőző folyadékot visznek fel, majd a lyukat egy darab ragasztóval lezárják. Nincs szükség az első lyuk bezárására, mivel a héj membránjának belső rétegét ez a fertőzési módszer nem zavarja, és továbbra is gátat képez a környezet mikroflórája számára.

Az ezzel a módszerrel fertőzött embriók további inkubálása vízszintes helyzetben, felnyíló oldallal történik.

Fertőzés a sárgája zsákban.

Legtöbbször chlamydia, valamint Marek-kór vírusai, lovak orrnyálkahártya-gyulladása, juhok hurutos láza stb. szaporodására használják. 5-7 napos, néha 2-3 napos embriókat fertőznek meg. (RIF völgyláz vírus). Kétféle fertőzés létezik.

Első lehetőség. Az embriókat függőleges helyzetben egy állványba helyezzük. A héjban a légkamra közepe felett lyukat készítünk, és a tűt 3,5-4 cm mélységig beszúrjuk a függőleges tengellyel 45°-os szögben, az embrió helyével ellentétes irányban. 20).

20. ábra: Csirkeembrió fertőzése a tojássárgája zsákba (Nicolau et al. szerint)

Második lehetőség. Néha hasonló fertőzési útvonalat hajtanak végre egy háromlábú, vízszintesen rögzített embrión; az embrió alul van, a sárgája pedig felette. A héjon lévő lyukat egy csepp olvadt paraffinnal zárjuk le.

Fertőzés a magzatvíz üregébe.

Erre a célra 6-10 napos embriókat használnak. A módszert influenzavírusok, Newcastle-betegség, lovak orr-pneumoniája stb. tenyésztésére használják. A fertőzésnek két módja van.

Zárt út. A fertőzést sötétített dobozban végezzük. A tojást ovoszkópra helyezzük vízszintes helyzetben, az embrióval felfelé. Egy tompa végű tűt a légkamra feletti héjon lévő lyukon keresztül vezetnek be az embrió felé. Annak bizonyítéka, hogy a tű áthatolt az amnionon, az embrió testének mozgása a mozgás irányába.

Nyitott út. A légkamra feletti héjat úgy vágják le, hogy 1,5-2,5 cm átmérőjű ablak keletkezzen, amelyen keresztül a héj membránját csipesszel szem irányítása alatt eltávolítják. Ezután anatómiai (14 cm) zárt ágú csipesz vezet, amely a chorionallantois membránt az embrió felé tolja. Amikor a csipesz eléri, a pofákat kinyitják, a HAO-val együtt fogja meg a magzatvíz membránt és húzza az ablakhoz. Bal kézzel fogva a csipeszbe rögzített amnionhéjjal, fecskendezze be a vakcinázott anyagot (21. ábra). Ezután az összes héjat leeresztik, az ablakot ragasztóval lezárják, és az embriót függőleges helyzetben inkubálják.

21. ábra Csirkeembrió fertőzése az amnionba nyílt módszerrel (Nicolau et al. szerint)

Fertőzés a CAO ereiben.

A 11-13 napos embriók ovoszkópos vizsgálatakor nagy véredény figyelhető meg. Ennek során a héj egy részét eltávolítjuk, 1-2 csepp alkoholt csepegtetünk, ami egy ideig átlátszóvá teszi a héjhéjat. Az ovoszkópon lévő szem irányítása alatt a tűt az érbe helyezik, amit a tű kis oldalirányú mozgásaival való mobilitása igazol. A héj szabad területét egy darab ragasztó vakolat borítja.

Lehetőség van az anyag bejuttatására az edényekbe kissé eltérő módon: a légkamra felett levágjuk a héjat, a héj membránját alkohollal megnedvesítjük, és az anyagot a látható CAO edényekbe juttatjuk. A lyukat egy darab steril ragasztószalaggal zárjuk le.

A csirkeembriók kísérleti fertőzésének leírt technikái nem az egyedüliek, hanem különböző lehetőségeket kínálnak.

Fertőzés az embrió testébe.

A fertőzéshez 7-12 napos embriókat használnak. A módszernek két változata ismert.

Első lehetőség. Fertőzés ugyanaz, mint az amnionban zárt módon, azzal a különbséggel, hogy éles tűt vesznek fel, és az ovoszkópon az embrió alárendeltségét a tű mozgásának tekintik a tű testbe jutásának mutatójának.

Második lehetőség. Ugyanúgy fertőznek, mint az amnionban nyílt módon: a héjban lévő ablakon keresztül csipesszel húzzák ki az embrió testét. Az anyagot az agyba vagy a test bizonyos területeire fecskendezik. Az ilyen fertőzési módszerekkel a nem specifikus embriópusztulás jelentős százaléka.

Vírus felhalmozódása csirkeembrióban

A bármilyen módszerrel fertőzött csirkeembriók héján történő további inkubálás előtt egyszerű (grafit) ceruzával felírják, hogy az embrió mivel és mikor fertőződött meg, és ha szükséges, egyéb információkat is. A fertőzött csirkeembriókat termosztátba helyezzük további inkubáció céljából, amely során a bejuttatott vírusok szaporodnak és felhalmozódnak a megfelelő struktúrákban. Az embriók inkubációs hőmérséklete 33 és 38 ° C között változik, a fertőzött vírus tulajdonságaitól függően. Az embriókat folyamatosan figyelik, ovoszkópon nézik, kiválasztják az elhunytakat.

Az embriók elhalását a fertőzést követő első 24 órában leggyakrabban a gombák elszaporodása, az oltóval együtt az embrióba juttatott bakteriális mikroflóra, vagy a fertőzés során bekövetkező sérülés okozza. Ez a halál nem specifikus. Többben késői időpontok az embriók általában a vírus embrióiban való szaporodás eredményeként pusztulnak el. Miután megtalálták az elhalt embriókat, azonnal áthelyezik őket egy 4 ° C-os hűtőszekrénybe. Az ilyen állapotok egyrészt hozzájárulnak az embrióban felhalmozódott vírus aktivitásának megőrzéséhez, másrészt a szövetek tömörödéséhez, az erek pusztulásához, ami nagyban megkönnyíti a későbbi kinyílást.

Az embriókat a vírus maximális felhalmozódásáig inkubálják. Ez az időszak minden vírusra, sőt törzsre is specifikus, és 2 és 7-8 nap között változik. Tehát a Newcastle-betegség H törzsének vírusa esetében ez 2-3 nap, a B törzs azonos vírusának esetében 5 nap, a madarak fertőző laringotracheitisének vírusa esetében - 5 nap stb. Ezután az összes embriót hűtéssel elpusztítják. 4 °C-on legalább 3-4 órán át és nyitva.

Kibontott tojások.

A módszer alapja az embrió eltávolítása a tojásból abban az időszakban, amikor a chorionallantois membrán belülről teljesen szomszédos a héjával. Ha egy ilyen tojás belsejébe tápközeget adnak, akkor egyfajta szövettenyészet képződik, amelyben a vírus szaporodni tud. A módszernek számos előnye van: lehetővé teszi, hogy tisztább vírust kapjon, mint az allantois-magzatvízben, ami fontos az ebből az anyagból készült vakcinák allergén tulajdonságainak csökkentése szempontjából; a sárgájazsák hiánya, és ezért a benne található specifikus antitestek, lehetővé teszik egyes vírusok jobb szaporodását. Bizonyos esetekben ez a módszer ad szép eredmények diagnosztikai munkában, mivel nagy mennyiségű vizsgálati anyagot képes bevinni, ami növeli a vírusizoláció lehetőségét.

A módszert Bernkopf javasolta már 1949-ben, de az alkalmazási nehézségek miatt nem terjedt el. Ezek a nehézségek a chorionallantois membrán azon képességével kapcsolatosak, hogy az inkubálás során elválik a héjtól, ami csökkenti a tenyészet értékét, és megnehezíti a vírus megszerzésének és a tápközeg cseréjének manipulálását.

E. Groiel (1963) számos olyan módosítást vezetett be, amelyek kiküszöbölték ezeket a nehézségeket. 15 napos vagy még régebbi tojások használatát javasolta, amelyeket a keltetés során gyakran meg kell forgatni, hogy a héj egyenletesen fejlődjön a tojáshéjon. Ha áttetsző, a légkamra határai láthatók. A héjat e vonal felett 0,5 cm-rel lefűrészeljük, olvadt paraffint (56-58 C °) öntünk a héj szélére, amely megszilárdítja és rögzíti a tojás szélét. Ezután egy kerek lyukat vágunk az embrió feletti héjba, keskeny peremet hagyva körül. A következő lépés az embrió óvatos eltávolítása a tojásból. Ebben az esetben a tojást vízszintes helyzetben kell tartani, és lassan el kell fordítani. Ily módon az embriót a CAO-val összekötő ereket megtalálják és ollóval levágják. Ha a tojást függőlegesen tartják, az embrió a tömegével együtt lehúzza a héjat, általában a tojás éles végének környékén letépi azt. Már kis mennyiségű folyadék behatolása a HAO és a héj közé a héj teljes leválását okozza 1-2 napon belül.

Az embrió eltávolítása után a tojást bélelő héjat sóoldattal többször megmossuk, 4-0 °C-ra hűtjük, amíg a folyadék átlátszóvá nem válik. Ezután 20 ml 37 ° C-ra melegített táptalajt vezetünk a tojásüregbe, és a tojást steril gumisapkával lezárjuk, előzetesen paraffinba merítve. A tojásba szerelt gumidugóval ellátott cső lehetővé teszi a folyadék összegyűjtését és bejuttatását a bakteriális szennyeződés veszélye nélkül. Egy ilyen biológiai objektum több napig életképes marad.

Yoshino és mások módszere szerint a deembrinált tojások üregét Hanks-oldatban készült agar-oldattal töltik meg. A deembrinált tojásokat egy kupakban lévő csövön keresztül oltják be.

Ellenőrző kérdések:

1. A csirkeembrió szerkezete.

2. Mire használják a csirkeembriókat a virológiában?

3. Milyen felépítésű a fejlődő csirkeembrió?